Контролирующая функция теломеры

Контролирующая функция теломеры

Теломеры — необходимые генетические элементы, которые состоят из специ­фических ДНК-повторов и белков, ассоциированных с ними. Теломеры прикры­вают концы хромосом, предотвращают их слипание и генетическую нестабиль­ность.

Теломерная ДНК теряет некоторую свою часть с каждым циклом репликации и по другим причинам, включая вредное действие окисления ДНК. Эта потеря компенсируется удлинением теломеры ферментом обратной транскриптазой — теломеразой. В большинстве гемопоэтических клеток теломеразная активность строго контролируется и присутствует в ограниченном количестве. В результате этого теломеры в лейкоцитах укорачиваются с возрастом как при трансплантации In vivo, так и при культивировании In vitro. Прогрессивное укорочение теломер приводит не только к дисфункции теломер и апоптозу, но и к стимуляции хро­мосомной нестабильности и гематологическим нарушениям, таким как MDS и хронический миелолейкоз (CML). Таким образом, в клетках гемопоэтической си­стемы теломеразы и теломеры играют важную роль, а именно: укорочение тело — меры — опухоль подавляющий механизм у долгоживущих млекопитающих, кото­рый ограничивает рост большинства (но не всех) стволовых клеток и лимфоци­тов.

Структура и функция теломер. Теломеры или концы линейных хромосом у всех позвоночных состоят из тандемных повторов TTAGGG/CCCTAA и ассоции­рованных с ними протеинов. Длина повторов колеблется между хромосома­ми внутри вида и между видами. У человека длина теломерных повторов состав­ляет 2-15 т. п. что зависит от типа ткани, возраста индивида и репликативной жиз­ни клетки. Концы индивидуальных хромосом также различаются по длине. Так, хромосома 17р типично имеет самую короткую длину теломерных повторов. Те­ломеры защищают концы линейных хромосом от возникновения разрывов ДНК, деградации и склеивания. Теломеры также играют роль в процессе мейоза и орга­низации хромосом в ядре. Теломеры содержат ДНК-связывающие белки, спе­цифические для двойных теломерических ДНК, которые включают TRF1 и TRF2, и специфический белок для одиночного нитевидного выступа, который обычно присутствует на 3?-концах хромосом.

Известно также, что многие другие бел­ки не напрямую связывают теломеры (через TRF1 и TRF2). Однонитевые вы­ступы в 3’-конце теломеразных складок возвращаются к двойной теломерической ДНК, формируя защитную Т-петлю. С теломерными повторами 3’-выступ связы­вается через TRF1 путем, который еще не совсем понятен, но является важным для теломерной активности.

Теломеры и репликационное старение. В отличие от эмбриональных стволовых клеток или опухолевых кле­точных линий гемопоэтические стволовые клетки не бессмертны. Еще 40 лет назад Hayflick предположил, что жизнь большинства нормальных клеток человека не может длиться бесконечно, она запрограммирована на определенное количество клеточных делений. В 1990 г. в нескольких работах была описана потеря те­ломер с возрастом и репликацией. Было высказано мнение, что прогрессивное теломеразное укорочение может объяснить предположение Hayflick. Эта модель была подтверждена последующим исследованием, показывающим, что перенос гена теломеразы (обратной трансферазы) может предотвратить укорочение теломер и привести к бессмертию клеток, которое Hayflick изучал длительно у нор­мальных диплоидных фибробластов человека.

С тех пор опубликовано много со­общений, совместимых с представлением о том, что укорочение теломеры ограни­чивает количество делений, на которое способно большинство нормальных ди­плоидных клеток. Достигнуто согласие в том, что укорочение теломеры развива­лось как контрольный механизм у долгоживущих млекопитающих, который кон­тролирует неограниченную и опасную для жизни пролиферацию органоспецифических стволовых клеток и лимфоцитов.

Контрольные пункты и геномная интеграция. ДНК постоянно находятся под дей­ствием как вредных факторов окружающей среды, так и продуктов нормального метаболизма, например, реактивных дериватов кислорода. Для поддержания воспро­изводства точных копий генетической информации следующими поколениями ме­ханизм клеточного цикла перекрывается серией пунктов наблюдения, названных «контрольными пунктами клеточного цикла». Основная функция этих конт­рольных пунктов — определить поврежденную или неправильно построенную ДНК и координировать продвижение клеточного цикла с реставрацией ДНК.

Термин «контрольный пункт» был сначала определен как «контрольный меха­низм, усиливающий зависимость в клеточном цикле». Но в дальнейшем стало ясно, что контрольные пункты повреждения ДНК контролируют восстановление ДНК и репликационные процессы вдобавок к замедлению клеточного цикла. Клет­ки разных организмов имеют различные стратегии ответа на стресс и поврежде­ние ДНК. По сравнению с одноклеточными многоклеточные организмы требуют не только более высокой точности репликации ДНК и ее реставрации, но и боль­шего разнообразия в ответ на повреждение ДНК. Так, например, у дрожжей ответ может быть описан как двойной между клеточным циркулированием и останов­кой. У млекопитающих он более сложный и включает в себя такие явления, как апоптоз и старение. Более сложный ответ у многоклеточных организмов стал воз­можным благодаря новому регуляторному контрольному модулю, которого нет у дрожжей, и который включает ген опухолевой супрессии р53. Выясни­лось также, что долгоживущие млекопитающие, как и люди, приобрели добавоч­ный уровень надзора за геномной интеграцией, который не функционирует у мле­копитающих с короткой жизнью, например, у грызунов. Этот дополнительный контрольный пункт связан с длиной и функциями теломер. Термин «теломерный контроль» можно использовать для описания этой опухолеподавляющей функции.

Утрата теломерной ДНК. Теломерная ДНК утрачивается в клетках человека в процессе репликации, репарации и ремоделирования ДНК. Причины утраты те­ломер включают «проблемы репликации конечных участков», нуклеолитический процессинг 5?-конца цепи и ошибки в репарации повреждений теломерной ДНК, вызванных окислением. Относительный вклад каждого из этих механизмов в общее укорочение теломер с возрастом неизвестен и, скорее все­го, варьирует в зависимости от типа клеток и возраста.

Процесс укорочения теломер в связи с окислительными повреждениями был обнаружен совсем недавно. Известно, что теломерная ДНК, богатая G-повторами, в 10 раз больше подвержена окислительным повреждениям, чем нетеломерная ге­номная ДНК. Восстановление окислительных повреждений происходит обычным путем, то есть вырезанием поврежденных нуклеотидов. Этот механизм может быть неэффективным для теломерных участков, так как при достижении репликационной вилкой конца хромосомы связь между матрицей и вновь синте­зированной цепью ослабевает. В целом, вклад окислительных повреждений в уко­рачивание теломерных участков требует тщательных исследований.

Основные сигнальные пути теломер. Механизм, посредством которого теломеры сигнализируют о повреждении ДНК, изучен крайне недостаточно. В настоя­щее время установлено, что индивидуальный теломерный участок может быть «включен» или «выключен» в плане сигнализации о повреждении. Представля­ется, что 3?-конец ДНК генерирует такие сигналы. В этот процесс включаются так­же ATM и р53, остальные детали неизвестны.

Важным является вопрос: На каком этапе клеточного цикла возникает сигнал? Репликация ДНК обязательно включает в себя процесс ремоделирования струк­туры теломер. Так как известно, что утрата теломер происходит во время репли­кации ДНК, то предполагается, что сигнал о повреждении ДНК возникает во вре­мя S — или С2-фаз клеточного цикла. Однако, когда в диплоидных фибробластах человека процессы репликации замедляются, их рост необратимо останавливает­ся в фазе G. Было также показано, что теломеры постоянно «включены» или «выключены», даже когда клетки находятся в фазе G0/Gj. При этом предполага­ется, что включенное состояние обратно и непрямо коррелирует с длиной теломерных повторов. В соответствии с этим сила сигнала о повреждении ДНК, гене­рируемого теломерами, будет возрастать по мере укорочения теломер. С этой мо­делью согласуются антиапоптозный эффект длинных теломер, экспрессия теломеразы, повышение уровня р53 в стареющих клетках (с укороченными теломерами). Усложняют исследование длины теломер различия между организмами и клетками в длине теломер, необходимой для активации сигнальных процессов. Нет сомнений, что эти отличия частично объясняют выраженные различия в длине те­ломер у клеток одинаковых типов различных индивидуумов одного и того же воз­раста.

Роль теломераз и альтернативных путей. Для компенсации потери теломеразных повторов клеткам необходима экспрессия функционирующей теломеразы. Теломераза — рибонуклеопротеин, содержащий белок теломеразы обратной транс­крипции (hTERT) и теломеразную РНК-матрицу (hTR) в качестве обязательных компонентов. Описаны белки, которые важны для сборки теломеразы и ее стабиль­ности. Теломераза наращивает 3’-конец теломеры. Уровень теломераз очень высо­кий в бессмертных клетках, где он поддерживает постоянную длину теломер. Та­ковыми клетками являются стволовые половые клетки в семенниках или эмбриональных стволовых клетках. Интересно, что некоторые редкие стволовые клетки, например мезенхимальные, также содержат достаточное количество теломераз для поддержания длины теломер. Неограниченная пролиферативная активность таких клеток имеет определен­ное терапевтическое будущее, так как позволяет производить некоторые генети­ческие манипуляции и выбирать клетки с нормальным кариотипом без ограни­чений, свойственных клеткам с лимитированным сроком жизни.

Пока неизвестно, почему уровни теломераз недостаточны для поддержания по­стоянной длины теломер в стволовых кроветворных клетках. Тем не менее, суще­ствующие в этих клетках уровни теломераз функционально значимы, о чем сви­детельствуют примеры заболеваний врожденным дискератозом. Пациенты с аутосомно-доминантной формой этого заболевания имеют одну нормальную и одну мутантную копию гена теломеразной РНК-матрицы. У них наблюдается незначи­тельное снижение активности теломераз и на этом фоне они обычно страдают апластической анемией, иммунодефицитами, опухолями и редко доживают до 50 лет. Эти наблюдения резко контрастируют с результатами исследований на мышах, у которых даже полное отсутствие теломеразной активности не влияет на их жизнь в течение шести поколений. Данные результаты наряду с возрастным снижением длины теломер в лейкоцитах доказывают гипотезу о том, что уровни теломераз в кроветворных клетках человека ограничены и жестко регулируются.

Роль альтернативных путей в удлинении или сохранении постоянной длины теломерных участков не совсем ясна. Наиболее вероятно, что эти механиз­мы неэффективны в клетках, экспрессирующих теломеразу. Из-за ограничения удлинения теломер теломеразой и/или альтернативными путями в кроветворных клетках молекулярные дефекты, выражающиеся в ускорении укорочения теломер, могут привести к апластической анемии. Во многих случаях непонятно, на­рушения в клетке влияют напрямую или косвенно на укорочение теломер. При дискератозе, например, наблюдается прямая связь с дефицитом теломераз, в то время как при анемии Фанкони укорочение теломер напрямую вызвано дефек­тами репарации теломерной ДНК либо опосредованно дефектами стволовых кле­ток, что сопровождается компенсаторной пролиферацией оставшихся стволовых клеток.

Теломерный контрольный пункт. Вслед за потерей теломерных повторов сигнал повреждения ДНК генерируется, наиболее вероятно, через регуляцию р53. В слу­чае, когда короткие теломеры затем удлиняются путем «теломерного восстанов­ления», включая теломеразу и/или рекомбинацию, остановка клеточного цикла будет временной.

Продолжение потери теломерической ДНК, в конце концов, генерирует слиш­ком много коротких теломер, что ограничивает возможности путей восстановле­ния теломер.

Нормальные клетки, как и предраковые, умирают вследствие апоптоза или пе­рехода в безответное состояние («репликационное старение»), зависящее от отве­та высоким и поддерживающим уровнем р53 в особенном виде клеток. Возмож­но, репликационный отрезок жизни в клетках долгоживущих видов был под се­лективным давлением для разрешения достаточного количества делений, обеспе­чивающего клеточные функции на протяжении нормального времени жизни, дей­ствуя как перерыв для предотвращения чрезмерной клеточной пролиферации и развития опухоли.

В большинстве гемопоэтических клеток необходимый баланс достигается ре­гуляцией теломерической активности на уровнях, достаточных для обеспечения нормальной длины в отношении 92 теломер в клетке человека.

Ограничение уровня активности теломеразы и, в результате, укорочение теломер могут влиять на старение организма, как минимум, двумя путями. Во-первых, некоторая возрастающая пропорция клеток может достигнуть конца их запрограм­мированного пролиферативного отрезка жизни в пожилом возрасте. Как резуль­тат, ответы Т-клеток могут быть подвергнуты риску в дальнейшем (с возрастом). Во-вторых, экспрессия гена в клетках при старении может быть необычной с абберантной секрецией соответствующих молекул, включая энзимы и цитокины. Оба фактора могут ослаблять иммунный ответ у людей старшего возраста.

Изучение биологической роли теломеры в отношении старения человека толь­ко начинается. Основная трудность в этом вопросе — необходимость долгосрочных наблюдений у людей и неадекватность моделей на грызунах.

Укорочение теломер в ядерных клетках крови человека. Как показали важные наблюдения, теломеры зрелых лейкоцитов крови значительно короче по сравне­нию со сперматозоидами того же донора. Уменьшение соматических теломер было выявлено тремя путями.

В первоначальных исследованиях было установлено, что теломеры в клетках разных тканей короче у более старших доноров. Затем появи­лось большое количество работ, из которых следовало более значительное пони­мание укорочения теломер в ядерных клетках крови человека. Исследования были облегчены развитием количественной флюоресценции на основе гибридизации In situ (FISH), позволяющей измерить длину теломер в висячих клетках, исполь­зуя проточную цитометрию. С помощью этой методики было установле­но, что возрастное уменьшение длины теломер в лимфоцитах более четкое, чем в гранулоцитах, и что более быстрое укорочение теломер в ранний период жиз­ни сопровождается более медленным уменьшением в последующем.

Длина те­ломер в гранулоцитах может использоваться как искусственный маркер для дли­ны теломер в гемопоэтических стволовых клетках, если предположить, что ко­личество делений клеток между стволовыми клетками и гранулоцитами отно­сительно постоянно на протяжении жизни и, что укорочение теломер в стволовых клетках, в основном, зависит от репликации и относительно постоянно с каждым делением клетки. Эта гипотеза была использована для моделирования оборота гемопоэтической стволовой клетки человека на основе данных длины теломер.

Интересно, что длина теломер у человека в любом возрасте весьма гетерогенна. В основном, это обусловлено генетически. Например, 70-летние монозигот­ные близнецы имели очень близкую длину теломер и в гранулоцитах, и в лимфо­цитах. Дизиготные близнецы различались больше, но все же не так, как неродствен­ные индивиды. Использование FISH-метода позволило установить быстрое уко­рочение теломер на ранних этапах жизни, замедление к 50-60 годам и в дальней­шем ускорение процесса укорочения. И в гранулоцитах, и в лимфоцитах он име­ет нелинейный характер и соответствует кубической кривой.

Уменьшение длины теломер Т-клеток может активировать контрольный пункт теломеры в специфических Т-клетках и натуральных киллерах (NK) в течение нор­мального периода жизни и, как результат, снижать иммунный ответ с возрастом.

В свете возрастных изменений длины теломер в гранулоцитах кажется неверо­ятным, что гемопоэтические стволовые клетки во время нормального гемопоэза сталкиваются с необратимой остановкой клеточного цикла или подвергаются апоптозу вследствие укорочения теломер. Вероятно, общая продукция кроветворных клеток из одной гемопоэтической стволовой клетки, в основном, определена диф­ференциацией стволовых и предшествующих клеток, а не репликативным старе­нием. Более того, потеря индивидуальных стволовых клеток через укорочение те­ломер не должна влиять на общий гемопоэз (или общую длину теломер в грану­лоцитах) при избыточном количестве дополнительных гемопоэтических стволо­вых клеток. То, что нормальные гемопоэтические стволовые клетки и ткани име­ют обширный репликационный потенциал, согласуется с большим опытом ис­пользования аллогенной и аутологичной трансплантации стволовых клеток.

Не­смотря на это, контрольный пункт теломеры действует в гемопоэтических ство­ловых клетках возрастной потерей длины теломеры в гранулоцитах после алло­генной трансплантации и апластической анемии, которая следует за частичной теломерной недостаточностью.

Недавние исследования показали, что количество гемопоэтических стволовых клеток может измениться путем воздействия на процессы, которые контролиру­ют самообновление и дифференциацию. Действительно, количество зрелых конеч­ных клеток, таких как гранулоциты, выработанных индивидуальными стволовы­ми клетками, вероятно, весьма разнообразно и, в основном, определяется процес­сами, которые регулируют самообновление против дифференциации на уровне индивидуальных стволовых клеток. Даже ограниченное количество дополнитель­ных делений самообновления в стволовых клетках значительно увеличивает про­дукцию клеток. В результате индивидуальные стволовые клетки могут произво­дить неодинаковое количество клеток. Это показано в клональных пролиферативных нарушениях, таких как пароксизмальная ночная гемоглобинурия и хронический миелолейкоз (Сhronic myelogenous or myeloid leukemia, CML). Даже при хроническом миелолейкозе клонально размноженные Филадельфия-позитивные стволовые клетки бывает сталкиваются с контрольным пунктом теломеры. К сожалению, при большом количестве клеток для отбора генетическая нестабильность, стиму­лируемая потерей функциональных теломер, способствует селекции клона с до­полнительными генетическими нарушениями и большими злокачественными склонностями.

Не все клетки в гемопоэтической системе запрограммированы на столкновение с контрольным пунктом теломеры. Особо интересным исключением являются В — клетки, так как с возрастом увеличивается гетерогенность в длине теломер. Неко­торые В-клетки выделяют достаточно теломеразы (и, вероятно, другого фактора) для эффективного удлинения теломер. Возможно, много клеточных делений, не­обходимых для эффективной селекции и «родственного созревания» антител, сво­бодно проходят контрольный пункт теломер. Предполагается, что В-клетки, в ре­зультате этого, больше подвергаются риску развития опухолей, что объясняет бо­лее высокую частоту В-, чем Т-лейкозов в человеческой популяции.

На основании многих наблюдений в нескольких областях биологии оказалось, что теломеры — важные регуляторные элементы, которые контролируют количе­ство делений нормальной соматической клетки человека. Активация контрольного пункта теломеры является результатом потери теломерической ДНК при репли­кации и оксидативном ее повреждении.

Ответ на повреждение ДНК, который зак­лючается в активации контрольного пункта теломеры, может проявиться удлине­нием теломеры, что включает теломеразу или рекомбинацию. В большинстве со­матических клеток, включая гемопоэтические стволовые клетки, возможность та­ких путей восстановления теломер оказывается ограниченной. Укорочение теломеры эффективно ограничивает пролиферативную потенцию таких клеток. Веро­ятно, что контрольный пункт теломеры развился как опухолево-супрессорный ме­ханизм у долгоживущих видов. Функция контрольного пункта теломеры может объяснить малопонятные аспекты биологии стволовых клеток, включая истоще­ние стволовых клеток при апластической анемии и других пролиферативных на­рушениях.

Клетки могут обходить контрольный пункт теломеры, экспрессируя высокий уровень теломеразы или инактивируя нижележащие сигнальные собы­тия (утрата функции р53). Некоторые клетки, включая подтипы В-лимфоцитов, могут обходить все контрольные пункты теломеры, и высокий уровень активнос­ти теломеразы может способствовать большей чувствительности этих клеток к раз­витию опухоли. Потеря функции р53 также инактивирует контрольный пункт теломеры. Такое явление довольно редкое, так как оба аллеля р53 в клетке долж­ны утеряться либо мутировать в случае продолжения пролиферации в присут­ствии многих коротких и дисфункциональных теломер. Утрата функции р53 при­водит к хромосомным слияниям и разрывам, и, как следствие, — к генетической нестабильности и способствует злокачественному прогрессированию. Это проил­люстрировано при хроническом миелолейкозе, где начало кризиса болезни и дополнительных генети­ческих изменений обратно пропорционально длине хромосом в Филадельфия-по­зитивных клетках при хронической фазе заболевания.

Таким образом, плюрипотентные свойства эмбриональных стволовых клеток, которые определяются способ­ностью формировать эмбриональные зародышевые клетки и их дифференциро­ванные производные In vitro и In vivo, представляют особый интерес для фунда­ментальных и прикладных исследований, особенно при клеточной терапии и изу­чении раннего эмбрионального развития.

Этими клетками можно манипулировать In vitro путем контроля условий рос­та или проведения генетических модификаций, управляя их дифференцировкой в специфические типы клеток. Однако механизмы, с помощью которых эти клет­ки приобретают широкий потенциал развития или остаются недифференцирован­ными, до сих пор в большинстве своем не изучены. Еще предстоит выяснить, ка­кие функциональные молекулы и каким образом участвуют в поддержании само­обновления и сохранении плюрипотентности.


Карта сайта


Информационный сайт Webavtocat.ru