Генетическое манипулирование эмбриональными стволовыми клетками

Генетическое манипулирование эмбриональными стволовыми клетками

Генные мишени широко используются в опытах на мышах. Наиболее часто вво­дили нулевые мутации в конкретный ген, используя гомологичную рекомбина­цию в эмбриональных стволовых клетках для определения роли этого гена в раз­витии организма или с целью создания модели болезни человека.

Трансген­ные животные, у которых интересующий ген запускает экспрессию меченого ве­щества (обычно?-галактозидазы), широко используются для контроля экспрес­сии генов в процессе развития. В то же время сверхэкспрессия генов для этих це­лей не нашла широкого применения, хотя были работы по сверхэкспрессии инсулиноподобного фактора роста-1, выработке модели амилоидных неврологичес­ких процессов, сверхэкспрессии протоонкогена v-src.

Эмбриональные стволовые клетки использовались также для фильтрации генов, специфичес­ких по стадии и ограниченных по происхождению, с применением метода ввода вектора захвата или конструкции улавливания экзона или промотора, или мута­генеза секреторных улавливателей, чтобы идентифицировать пути происхождения клеточной сигнализации в развитии.

Применяется эмбриональные стволовые клетки и для идентификации генов стволовых клеток, рестрикцированных Oct3/4-reHOM с использованием гибридизационного анализа с вычита­нием супрессии или генами, которые экспрессируются в ответ на конкретные фак­торы роста мышиных или человеческих эмбриональных стволовых клеток.

Успешным было также введение человеческих мини-хромосом в мышиные эмбриональные стволовые клетки как начало к разработке и введению искусственных хромосом в зародышевую ли­нию мышей.

Дифференцировка генприцельных эмбриональных стволовых клеток обычно требует преобразования эмбриональные стволовые клетки из +/- в «нулевой генотип» (-/-). Такой подход используется для определения дей­ствия делеции летальных для эмбриона генов на дифференцировку специфичес­ких типов клеток. Например, мутация гена «Huntingtin» (гентингтон) является смертельной на 7-й день, задолго для нейрогенеза, но из «нулевых» эмбриональные стволовые клетки образуются явно нормаль­ные нейроны.

Хотя эти методы дают возможность определить, является ли прицельный ген решающим для развития конкретных образований, многие «нулевые» линии растут чрезвычайно плохо In vitro или не растут совсем.

В эмбриональные стволовые клетки с успехом применялась их трансфекция для экспрессии соответствую­щего маркера, например, усиленный зеленый флуоресцентный белок (EGFP) или системно, или под контролем рестриктирующего гена.

По мере дифферен­циации эмбриональные стволовые клетки In vitro и экспрессии рестриктирующего гена экспрессируется и EGFP, что позволяет идентифицировать дифференцирующиеся клетки. Методика весьма эффективна, когда исследуемый ген имеет высокий уровень экспрессии во всех дифференцирующихся потомках. Так, миоциты сердечной мышцы были изо­лированы при использовании промотора сердечного альфа-актина для экспрессии EGFP.

Pratt et al. (2000) получили эмбриональные стволовые клетки, которые экспрессируют EGFP через гау — промотор — источник для трансплантации нейронов и изучения роста аксонов и регенерации. Разработана также линия эмбриональные стволовые клетки человека, которая рестриктируется геном Rex-1, запускающим экспрессию EGFP. Таким образом, поскольку стволо­вые клетки дифференцируются при пониженной экспрессии Rex-1, и клетки не экспрессируют EGFP, то создается система идентификации и отсортировки плю­рипотентных клеток.


Карта сайта


Информационный сайт Webavtocat.ru