Использование стволовых клеток в медицине

Использование стволовых клеток в медицине

Несмотря на то, что взрослые стволовые клетки, похоже, не имеют полной сиг­нальной системы, направленной на дифференцировку эмбриональные стволовые клетки в сайтспецифические клеточные фенотипы, необходимо трансплантировать производные эмбриональных стволовых клеток новорож­денным и взрослым.

Производные эмбриональных стволовых клеток получают при случайной дифференцировке и последующей селекции In vitro, а также в некоторых случаях путем направления дифференци­ровки эмбриональных стволовых клеток In vitro в более ограниченную по потенциальным возможностям груп­пу стволовых клеток, которые могут дифференцироваться по определенному пути в ответ на сохранившиеся сигналы, поддерживаемые интактными или поврежден­ными взрослыми тканями.

В нескольких экспериментах использовали производные эмбриональные стволовые клетки для коррекции дефицита тканей. Так, в результате случайной дифференцировки были получе­ны кардиомиоциты из эмбриональных тел мышей. Их вводили в мышцу желу­дочка mdx мышей с дистрофией. Трансплантат стабильно включался в сердечную мышцу хозяина, что доказано методом антидистрофинового окрашивания.

Мультипотентные глиальные клетки-предшественники, полученные путем на­правленной дифференцировки мышиных эмбриональных стволовых клеток In vitro, вводили в спинной и го­ловной мозг 7-дневной мутантной крысы с дефицитом миелина. Мутация копи­рует болезнь Polizaeus-Merzbacher. Тесты на протеолипидный белок, сателлитную ДНК мыши и GFAP показали, что введенные клетки дифференцируются в астроциты и олигодендроциты, которые ремиелинизируют аксоны спинного и голов­ного мозга. Сходные результаты были получены после трансплантации получен­ных из эмбриональных стволовых клеток предшественников олигодендроцитов в спинной мозг shiverer — мы­шей с отсутствием миелина — или в задние канатики взрослых крыс с химичес­ким поражением спинного мозга. Мультипотентные предшественники нейронов, полученные путем направленной дифференцировки эмбриональной карциномы мышей In vitro и введен­ные в поврежденные участки спинного мозга крыс, приводящих к параличам, на 9-й день после повреждения мигрировали из поврежденного участка и дифферен­цировались в нейроны, астроциты и олигодендроциты. В течение месяца крысы были в состоянии поднимать лапы и демонстрировали неловкие шагающие дви­жения передними конечностями, хотя полного функционального выздоровления достигнуто не было.

Остается неясным: восстанавливали ли трансплантированные клетки некоторые функции путем формирования новых соединений нейронов, ремиелинизацией аксонов хозяина, секрецией факторов, усиливающих регенерацию хозяина или какой-либо комбинацией этих факторов?

Одно из важных направлений клеточной терапии — Лечение печеночной недо­статочности, вызванной различными причинами. К настоящему времени накоп­лен большой экспериментальный и клинический опыт в решении этой пробле­мы. Одним из кардинальных способов ее решения является использование ство­ловых клеток печени, которые, сохраняя способность к пролиферации, могут пре­вращаться в специализированные клетки. При этом используются три типа кле­ток:

· эмбриональные стволовые клетки печени, которые в зависимости от условий культивирования могут превращаться в гепатоциты или клетки желчных ходов (эмбриональные стволовые клетки); · зрелые гепатоциты, к которым может вернуться способность пролиферировать; · овальные клетки (клетки печени непаренхиматозного происхождения с вы­раженной способностью к пролиферации).

Стволовые клетки желчных ходов возникают из клеток эндодермы, образую­щих печеночный дивертикул — зачаток, появляющийся на 22-й день эмбриональ­ного развития на брюшной стороне передней эндодермы зародыша человека Эмбриональные стволовые клетки образуют трабекулы, заселяя мезенхиму поперечной перегородки. Они об­наруживаются в печени эмбриона человека с конца 4-й недели (у крыс с 10-12-го дня). Они пролиферируют и дифференцируются либо в гепатоциты, либо в клет­ки желчных протоков. На этом этапе еще сохраняется дифференцировка. Гепато­бласты могут давать начало клеткам протоков, а из последних образуются оваль­ные клетки — недифференцированные клетки, из которых могут формироваться гепатоциты, клетки желчных ходов и клетки других органов (энтероциты, клетки поджелудочной железы).

Стволовые клетки желчных ходов можно изолировать из эмбриональной пе­чени в конце 2-й недели эмбриогенеза крыс или мышей и культивировать In vitro. В зависимости от условий культивирования эмбриональные стволовые клетки печени могут дифференцироваться в гепатоциты или клетки желчных ходов, которые отличаются по ультраструкту­ре и характерным маркером (альбумин, альфа-фетопротеин, цитокератины 1 и 18 в гепатоцитах и гамма-глутамилтрансфераза — в клетках протоков).

В клетках эндодермы еще до дифференцировки их в эмбриональные стволовые клетки печени экспрессируется ядерный фактор 3 гепатоцитов (фактор роста гепатоцитов 3) — один из наиболее ранних транскрипционных факторов, обнаруженных в печеночном дивертикуле. Вероятно, этот белок регулирует формирование эндодермы и дифференцировку клеток печени, так как экспрессируется раньше других белков, модулирующих транскрипцию.

Эмбриональные стволовые клетки, используемые для лечения печеночной не­достаточности, можно изолировать из эмбриональной печени при прерывании бе­ременности по медицинским показаниям, хотя в таких случаях возникают пробле­мы этического характера. Кроме того, по ряду важных признаков эмбриональные гепатоциты отличаются от зрелых гепатоцитов: глюконеогенез в печени человека начинается лишь на 4-й месяц эмбрионального развития, полярность эпителия ге­патоцитов у крыс исчезает через несколько недель после рождения, эмбриональ­ная печень экспрессирует альфа-фетопротеин, а не альбумин. Таким образом, ге­патоциты эмбриональной печени способны пролиферировать, но функцию пече­ни заменить не могут. Предпринимались попытки лечения молниеносной пече­ночной недостаточности эмбриональными гепатоцитами, которые вводили боль­ным в брюшную полость, но безуспешно.

Обнадеживающие результаты дали исследования по предварительной изоля­ции эмбриональной карциномы печени человека, их культивирования и дифференцировки In vitro. Клетки-предшественники из эмбриональной печени 14-дневного зародыша крысы изоли­ровали и вводили взрослым животным. Эти клетки заселяли пораженную печень животных, формировали печеночные трабекулы и желчные протоки. Такие ре­зультаты дают возможность найти перспективную альтернативу пересадке пече­ни.

Зрелые гепатоциты делятся крайне медленно. В норме в печени только 0,1-0,01% Клеток находятся в состоянии митоза. Частота митозов значительно увеличивает­ся при регенерации печени, например, после частичной гепатэктомии у крыс. В этом случае накопление клеток идет за счет деления зрелых дифференцированных гепатоцитов. Зрелые гепатоциты способны воспроизводить только себе подобных потомков.

Введение нормальных взрослых гепатоцитов в печень трансгенных мышей с тяжелым поражением печени обеспечивает почти полное заселение пораженного органа. Взрослые гепатоциты при этом сохраняли способность к пролиферации. Клетки делились до 77 раз, что сопоставимо с пролиферативной способностью кроветворные стволовые клетки. Успешные результаты были получены и в случае введения взрослых гепатоцитов крысам с приобретенными поражениями печени. Пересаженные клетки контактируют с гепатоцитами хозяина по всей дольке печени, а также с клетками желчных ходов. Они морфологически и функционально сохраняют свойства нормальных взрослых гепатоцитов и не превращаются в протоковые или опухолевые клетки.

В ходе этих исследований возник вопрос о том, все ли гепатоциты обладают спо­собностью к пролиферации. При фракционировании клеток было установлено, что гепатоциты среднего и крупного размера склонны к пролиферации. Они локали­зуются в медиальной и центральной частях печеночной дольки, мелкие — вокруг перипортального пространства. Из-за этой локализации мелких гепатоцитов не­которые исследователи считают их стволовыми клетками печени. Однако в экспериментах по регенерации после частичного удаления печени установлено, что в пролиферации участвуют все гепатоциты, независимо от месторасположения в дольке.

Необходимы дальнейшие исследования по изучению факторов, индуцирую­щих пролиферацию. Известно, что важная роль принадлежит факторам роста. Так, у мышей постоянная перфузия фактора роста гепатоцитов ведет к увеличению массы печени, пролиферации гепатоцитов, увеличению продолжительности жиз­ни гепатоцитов, несущих экзогенные конструкции. Через 1 неделю после введения ретрозина крысам почти все гепатоциты этих животных заменили донорскими клет­ками.

Овальные клетки — мелкие клетки непаренхиматозного происхождения. Они имеют скудную цитоплазму, большое ядро и крупное ядрышко. Обычно овальные клетки обнаруживаются после хронического введения животным канцерогенов или ток­синов печени.

Овальные клетки — потенциальные кандидаты на роль стволовых клеток печени. У них высокая пролиферативная активность. Как In vivo, так и In vitro они способны дифферен­цироваться в гепатоциты и протоковые клетки. Эти клетки экспрессируют харак­терные белки для гепатоцитов (альбумин, альфа-фетопротеин, цитокератины 8 и 18) и клеток желчных ходов (цитокератины 7 и 19).

Овальных клеток довольно много, их легко выделить, культивировать, изу­чать метаболизм. По мнению одних исследователей, овальные клетки происходят из клеток герингова канала (небольшой проток, соединяющий гепатоциты с клетками желчных ходов), другие считают, что они происходят из перидуктулярных кле­ток или из каких-то неизвестных предшественников, может быть, из мелких ге­патоцитов.

Из-за способности овальных клеток пролиферировать и превращаться в эпителиальные клет­ки их считали хорошим источником для пересадки в пораженную печень. Одна­ко на практике оказалось, что их введение приводило к развитию холангио — или гепатокарцином. Для предотвращения этих осложнений овальные клетки предварительно мо­дифицировали путем трансфецирования и получали нормальные гепатоциты.

Овальные клетки обнаружены и у человека при различных заболеваниях пе­чени. Их количество увеличивается пропорционально тяжести болезни. Возмож­но, именно они замещают пораженные гепатоциты, а не унипотентные гепатоци­ты.

Возможным источником стволовых клеток для лечения пораженной печени могут быть эмбриональные стволовые клетки. В зависимости от условий, как уже было сказано, они способны давать на­чало мышечным, нервным, эпителиальным клеткам. Исследования показали воз­можность развития кроветворных клеток в предшественники гепатоцитов. Были исследованы образцы печени самок крыс после пересадки костного мозга самцов.

Изучались также образцы печени мужчин после пересадки им печени женщины. Использование флуоресцентной гибридизации In situ для анализа хромосом в ин­терфазном ядре гепатоцитов позволило выявить высокий процент гепатоцитов, клеток желчных ходов и овальных клеток с Y-хромосомой. Эти результаты показали, что стволовые клетки есть в печени и дали начало зрелым клеткам.

При клинических испытаниях изолированные гепатоциты временно помеща­ли в биореакторы в русло искусственного кровообращения больного или подса­живали клетки в различные области. В биореакторах использовали нормальные взрослые аллогенные гепатоциты, а также ксеногенные гепатоциты, клетки гепатомы человека и иммортализированные гепатоциты человека. Первые обнадежи­вающие результаты получены при трансплантации фетальных клеток больным с тяжелыми поражениями печени.

Дальнейшие исследования механизмов пролиферации и дифференцировки стволовых клеток печени позволят приблизиться к широким клиническим испытаниям накопленно­го в экспериментах опыта трансплантации клеток печени.

Эмбриональные стволовые клетки и их производные широко используются для разработки методов Коррекции иммунодефицитов, вызванных генетически­ми дефектами созревания тимуса. В исследованиях используют нокаут Rag-гена мы­шей с пораженным аппаратом рекомбинации V (D)J локусов TCR-генов, что при­водит к полной утере функций Т — и В-лимфоцитами. Пересадка эмбриональных стволовых клеткок в тимус по­раженных животных приводит к восстановлению созревания нормальных попу­ляций иммунных клонов, ответственных за гуморальный и клеточный иммуни­тет. Пересадку ранних производных эмбриональных стволовых клеток, генерированных в культуре In vitro, ис­пользуют далее для лечения фатальных наследственных анемий детей.

Основные преимущества эмбриональных стволовых клеток человека как источника предшественников или дифференцированных клеток в том, что они могут размножаться без утраты плю­рипотентности. Это значит, что линии эмбриональных стволовых клеток могут потенциально обеспечивать лю­бой тип дифференцированных клеток в необходимых количествах. Другое преиму­щество эмбриональных стволовых клеток — отсутствие любого возможного влияния возврата, которое может быть связано с взрослой стволовой клеткой. Но эмбриональные стволовые клетки имеют и недостатки.

Во-первых, эмбриональные стволовые клетки человека выращиваются на питающих их мышиных фибробластах и существует реальный риск загрязнения их колоний клетками мыши. Во-вторых, эмбриональные стволовые клетки могут дать начало тератокарциноме. В-третьих, культивируемые эмбриональные стволовые клетки демонстрируют эпигенетическую нестабильность. Метилирование и экспрес­сия некоторых импринтированных генов была крайне вариабельна среди субкло­нов, дифференцированных ретиноевой кислотой, полученных из отдельных коло­ний одной клеточной линии в эмбриональные стволовые клетки мышей. В-четвертых, производные эмбриональных стволовых клеток мо­гут вызвать иммуноотторжение, за исключением иммунопревилигированных участков, таких как мозг, У мышей эта проблема была решена терапевтическим клонированием, т. е. комбинацией ядер соматических клеток с энуклеированной яйцеклеткой и получением линии эмбриональных стволовых клеток из образовавшихся бластоцист. Эмбриональные стволовые клетки, по­лученные таким образом, полностью плюрипотентны. Однако здесь наблюдается та же эпигенетическая недостаточность, как и в случае с культивированными эмбриональными стволовыми клетками. Из-за этого возникает вопрос: не имеют ли клетки, полученные из «персональных» эмбриональных стволовых линий, отклонений от нормы, которые, в конце концов, приведут к их дисфункции или разрушению?


Карта сайта


Информационный сайт Webavtocat.ru